A última aula Olímpica falou com todos.“Desenvolvimento prático da metodologia ELISA - Desenvolvimento de métodos quantitativos para a detecção de macromoléculas biológicas”- É.
Nesta edição, O'Rei compartilha com vocês outro tópico importante: "Desenvolvimento prático da metodologia ELISA - Desenvolvimento de métodos de medição de afinidade".

I. Introdução

Atualmente, os métodos usados ​​para determinar a afinidade entre ligandos receptores, ou seja, a constante de desequilíbrio, são principalmente:

1. Método de medição termodinâmica
2. Método de medição dinâmica
3. Método de concentração de saturação

Os métodos de medição dinâmica e concentração de saturação são mais comuns:Método de medição dinâmica(como Biacore)envolvendo instrumentos mais caros,O método de medição de concentração de saturação é o método de medição comumente usado pela grande maioria das empresas biofarmacêuticas domésticas.

O ELISA para a determinação da afinidade é o padrão principal da concentração de saturação e é frequentemente usado para avaliar a atividade dos níveis de proteínas de antígenos ou anticorpos e para avaliar a estabilidade dos anticorpos.
O ELISA é usado para medir a afinidade em kits que muitas vezes não são comercializados e requerem o desenvolvimento metodológico de pessoal experimental.

Devido à falta de educação em biotecnologia e à acumulação insuficiente de empresas de pesquisa e desenvolvimento de novos medicamentos nesta aplicação, um método de afinidade ELISA que possa ser verificado metodologicamente é uma coisa mais difícil para muitos profissionais, e é muito provável que falhas como erros ou desvios de transmissão de novos números ocorram.
Um desses erros é o desenvolvimento de métodos de determinação de afinidade ELISA usando as condições experimentais quantitativas de ELISA.

Este artigo começa com os princípios básicos do método de medição da afinidadeDescreve os princípios básicos da análise de afinidade por concentração de saturação, descreve a relação de dose de anticorpos antigénicos durante o desenvolvimento do método ELISA e vários erros que podem ocorrer durante a aplicação do ELISA para métodos de análise de afinidade, e apresenta os esquemas gerais de análise de afinidade e os esquemas de desenvolvimento metodológico preliminar.

Conceito básico de afinidade

Analisamos alguns casos de reações químicas para explicar o que é afinidade.

例子A
Hidrogênio e oxigênio produzem água em condições inflamadas.
Quando a reação for interrompida, se a concentração molar de hidrogênio no ambiente de reação acontecer ser o dobro da concentração molar de oxigênio, ambos são consumidos e apenas água no ambiente de reação; Quando a concentração molar de hidrogênio é maior do que o dobro da concentração molar de oxigênio, o oxigênio é consumido e apenas hidrogênio e água estão no ambiente de reação; Quando a concentração molar de hidrogênio é menor do que o dobro da concentração molar de oxigênio, o hidrogênio é consumido e apenas oxigênio e água estão no ambiente de reação.
Este é o conhecimento básico sobre a reação química, o resultado da reação química, o reator pode se transformar em um produto, ou seja, a reação pode ser realizada até o fim, a reação com as características do processo e do resultado de tais reações é chamada de irreversível.

例子B
Antígeno PD1(CD279)Anticorpos PD1(Por exemplo, pembrolizumabe)Reagir a temperatura normal e pressão normal.
Quando a reação está parada, se a concentração molar de CD279 no ambiente de reação é de 200nM, a concentração molar de pembrolizumab é de 100nM, a concentração do complexo de pembrolizumab-CD279 é de 97,86nM, a concentração molar de CD279 é de 4,28nM e a concentração molar de pembrolizumab é de 2,14nM em condições ideais;
Se a concentração molar de CD279 no ambiente de reação é de 100 nM e a concentração molar de pembrolizumab é de 200 nM, a concentração do complexo de pembrolizumab-CD279 é de 49,81 nM, a concentração molar de CD279 é de 0,38 nM e a concentração molar de pembrolizumab é de 159,19 nM em condições ideais.

Exemplo C
Antígeno PD1(CD279)Antígeno PDL1(CD274 em inglês)Reagir a temperatura normal e pressão normal.
Se a concentração molar de CD279 no ambiente de reação é de 200 nM, a concentração molar de CD274 é de 100 nM, a concentração do complexo CD274-CD279 é de 2,35 nM, a concentração molar de CD279 é de 197,65 nM e a concentração molar de CD274 é de 97,65 nM sob as condições ideais na conclusão da reação;
Se a concentração molar de CD279 no ambiente de reação é de 100 nM, a concentração molar de CD274 é de 200 nM, a concentração do complexo CD274-CD279 é de 2,35 nM, a concentração molar de CD279 é de 97,65 nM, a concentração molar de CD274 é de 197,65 nM, e a grande maioria de CD279 e CD274 não estão envolvidos na reação.
Casos B e C, ambos antígenos e anticorpos(ligantes e receptores)A reação de ligação, ambas as reações têm um processo de reação positiva para gerar o complexo, também há uma reação de dissociação do complexo para gerar antígenos, o processo de reação inversa de anticorpos, o resultado final é o estado de coexistência de antígenos, anticorpos e complexos antígeno-anticorpo.

Essa reação é chamadaReação reversível- É.
Quando a velocidade da reação positiva e inversa em uma reação reversível é igual, a concentração de antígeno no sistema de reação, a concentração de anticorpos e a concentração de complexo antígeno-anticorpo não aumentam nem diminuem, a reação reversível é concluída e a concentração molar de cada componente no sistema de reação está em equilíbrio dinâmico.

Afinidade(Afinidade)É o parâmetro característico do estado relativo entre antígeno, anticorpo e complexo antígeno-anticorpo durante a reação reversível, e seu nome mais especializado e terminológico é a constante de desequilíbrio KD, em unidades mol / L.(de acordo com as unidades de concentração)- É.

Quanto menor o valor de afinidade, maior a afinidade, e a força da afinidade determina quanto os componentes da reação reversível são relativos quando a reação é concluída.

Como nos exemplos B e C, o mesmo acontece com CD279 de 200nM.(PD1 em inglês)Reações, anticorpos pembrolizumab(Anticorpo PD1)A afinidade em relação a CD279 é de 0,4 nM, ligando CD274(PDL1)Com uma afinidade de 8200 nM em relação ao CD279, o complexo pembrolizumab-CD279 produzido pela reação final foi de 97,86 nM, enquanto o complexo CD274-CD279 foi de apenas 2,35 nM, com uma diferença de 42 vezes.

Diferentemente da reação irreversível, além da concentração molar de anticorpos antígenos, antígenos e anticorpos(ligantes e receptores)A afinidade entre os dois afetará * a quantidade de produtos gerados na reação reversível.

Você conhece os princípios básicos do desenvolvimento da metodologia ELISA?

Para uma visão geral dos métodos e princípios de determinação de afinidade, os leitores podem consultar a seção Avaliação de afinidade de técnicas de avaliação de triagem biofuncional.
Este artigo resume principalmente o método de concentração de saturação.
O RRepresentantereceptoresouantígeno，O LRepresentanteLigantesouAnticorpos- É.
Adotando o método de concentração de saturação, se você quiser medir a afinidade do ligando em relação ao receptor, na presença de uma pequena quantidade de R, diluir L em gradiente para detectar a concentração do complexo R-L, quando a concentração do complexo R-L representa metade da concentração total de R, o valor de concentração correspondente a L(EC50)O valor KD de L em relação a R.
O composto RL/R, ou seja, o valor B, pode ser detectado em vez do valor do sinal, e a relação funcional entre L diluído em gradiente e o sinal satisfaz a fórmula abaixo, somente quando o valor EC50 em condições experimentais específicas pode ser equivalente ao valor KD.
O método de concentração de saturação tem vários pontos-chave para determinar o valor de KD.Ou seja, as duas moléculas que interagem, R deve ser pequena quantidade, L deve ser diluído em gradiente contínuo, precisa obter o valor de resposta ao sinal(Todos os pontos de ligação de R são ocupados por L)ou seja, período de plataforma, então, nessas condições, ocupando metade R, a concentração L necessária(EC50)valor do KD.
O método de concentração de saturação determina principalmente os valores de sinal que representam o complexo RL. O método de medição pode ser citologia de fluxo, marcação isotópica, polarização fluorescente ou ELISA.

Desenvolvimento de Metodologia ELISA para Determinação de Afinidade

Layout

Processo operacional geral

01Preparação da placa de marcação enzimática: tomar a concentração de antígeno de 100 ug / ml, dissolver a temperatura ambiente, misturar com o líquido do pacote diluído para 0,2 ug / ml, 0,5 ug / ml, 1 ug / ml, adicionar 100ul / orifício de acordo com a tabela de layout da amostra, adicionar a placa de marcação enzimática, respectivamente(Nota 1)Em que a adição do pacote é líquido para o controle do pacote é anticorpo, 2-8 ° C durante a noite;
02Lave a placa 3 vezes com um líquido de lavagem, seque-a e adicione o líquido de fechamento de 300ul / buraco(Nota 2)Temperatura ambiente fechada por 1 hora; O líquido de lavagem lava a placa 3 vezes, para secar;
03Diluir anticorpos em gradiente 3 vezes a partir de 100.000 ng / ml de acordo com o layout(Nota 3)De acordo com o layout, 100ul / orificio é adicionado à placa microporosa;
04ColocarOscilladores de placas microporosas de Ohaus (ISLDMPHDG)Dentro, configurar 37 ° C, 600 rpm oscilação por 1 hora;

05Lavar a placa 3 vezes com líquido de lavagem e secar;
06Anticorpos ligados a enzimas diluídos à concentração adequada(Nota 4)EmO Torbino de Ahouse(VXMNFS)em cimamisturado, 100ul / buraco;

07Coloque-o no oscilador de placa microporosa e defina a oscilação de 37 ° C e 600 rpm por 1 hora;
08Lavar a placa 4 vezes com líquido de lavagem e secar;
09Tomar o líquido coloridor correspondente de anticorpos ligados a enzimas, extrair o equilíbrio a temperatura ambiente 20 minutos antes da administração e misturar em um misturador de vórtice;
10Coloração adicionada a 100 ul/buraco com 8 pistolas;
11Coloque o líquido colorido à temperatura ambiente por 10-30 minutos(Nota 5)；
12Terminar a reação com a adição de terminante a 100 ul / orifício usando 8 escopetas(Dependendo do substrato, esta etapa pode não ser necessária)；
13Determinação do valor do sinal com um calibrador enzimático(Nota 6)；
14Análise de resultados(Nota 7)- É.

Pequena nota

Nota 1:Se for necessário reduzir as altas concentrações de anticorpos durante a reação(100000ng/ml)A adsorção não específica da placa de marcação enzimática, durante o processo de embalagem, recomenda-se a escolha da placa de marcação enzimática hidrofóbica(Polisorpo)A concentração de antígeno envolvido requer uma pequena quantidade de 0,2-1ug / ml, caso específico precisa ser otimizado de acordo com o tamanho de afinidade de anticorpos de antígeno. Geralmente, quanto maior a afinidade, menor a concentração do pacote de antígeno necessário é.
Nota 2:O líquido fechado não tem necessariamente o efeito de fechamento, é necessário verificar experimentalmente(Agrupamento sem antígeno)Em geral, quanto menor o peso molecular, melhor o efeito do fechador.
Nota 3:No início do desenvolvimento da metodologia, a faixa de concentração da curva padrão pode ser ampliada de 100.000 ng / ml a 0,1 ng / ml para obter uma curva completa com um período de plataforma significativamente superior e inferior, quando a afinidade entre anticorpos antígenos é forte, a concentração de gradiente pode ser reduzida e o múltiplo de diluição pode ser reduzido para 2 vezes durante o processo de otimização da metodologia.
Nota 4:Efeito de excesso de anticorpos ligados a enzimas, a diluição de anticorpos ligados a enzimas precisa fazer diferentes graus de diluição para comparar a seleção, para os anticorpos ligados a enzimas do componente mono抗, se os dois graus de diluição de anticorpos ligados a enzimas são capazes de produzir a mesma curva de dose, indicando que o excesso de anticorpos ligados a enzimas, a transmissão de sinalização do ELISA não é desviado.
Para anticorpos enzimáticamente ligados com múltiplos anticomponentes, o julgamento da diluição é mais complexo, e a concentração molar de anticorpos enzimáticamente ligados pode ser calculada inicialmente mais de 5 vezes a concentração molar de antígeno na embalagem. Quando as concentrações de anticorpos ligados são menores, os anticorpos ligados são capturados em altas doses de diferentes concentrações de anticorpos, com curvas falsas sobre a plataforma.
Nota 5:Para substratos de valor de absorção e substratos fluorescentes, o valor do sinal do instrumento é proporcional ao tempo de exibição de cor, o controle em 10-30 minutos é adequado. É necessário confirmar com antecedência a gama linear do sinal do instrumento de detecção, por exemplo, a gama linear do sinal do valor de absorção do calibrador enzimático geral é de 0-3, o valor de absorção é não linear entre 3-4, no momento da exibição de cor, o valor do sinal deve ser controlado para não exceder 3, quando o valor do sinal excede a gama linear, a curva tem uma plataforma falsa.
Nota 6:Os diferentes substratos precisam ser testados com diferentes instrumentos, leitura de absorção de luz, leitura de fluorescência, leitura de luminescência química. Observe se o calibrador enzimático do laboratório possui esse tipo de função de leitura durante a seleção do substrato.
Nota 7:A curva de dosagem padrão é geralmente ajustada com quatro parâmetros e requer um período de plataforma claro para cima e para baixo.(Valores A e D)A inclinação é geralmente de 0,8 a 1,2.(Valor B)entre, EC50（Valor C)O valor de afinidade do anticorpo em relação ao antígeno.

V. Resumo

De acordo com o método de concentração de saturação, a análise de afinidade por ELISA requer uma curva S de quatro parâmetros clara, ou seja, uma curva de sinalização que varia gradualmente com a concentração de anticorpos.
Em baixas e altas concentrações de anticorpos, há um período de plataforma alto e baixo evidente, com metade dos valores de sinalização do período superior correspondendo à concentração de anticorpos(EC50)O valor é o valor KD da afinidade entre anticorpos de antígeno.
Como o alcance linear do sinal de detecção do instrumento é limitado, quando o sinal excede o alcance linear, a curva entra em um período falso sobre a plataforma, tornando a afinidade medida imprecisa.
A concentração de antígeno envolvida determina diretamente o valor do sinal.Portanto, quando a medição de afinidade é feita por ELISA, a concentração de antígeno envolvida é tão pequena quanto possível para obter o valor de sinalização adequado; As concentrações de anticorpos ligados a enzimas também podem levar a curva para o período de plataforma falsa.

Durante o desenvolvimento da metodologia de ELISA, a transmissão linear de sinalização por excesso de anticorpos ligados a enzimas precisa ser verificada experimentalmente.
Quando o sinal não pode ser obtido efetivamente no período de plataforma, a afinidade entre os anticorpos de antígeno é muito fraca ou envelhecida demais, e uma maior concentração de anticorpos é necessária para que todos os antígenos sejam capturados para atingir o período de plataforma.
Limitação da sensibilidade do ELISA, afinidade mais fraca em alguns(>100 nM)Entre os antígenos de anticorpos, o método ELISA não obteve um período de plataforma eficaz e valores de afinidade medidos.
Quando o teste de afinidade ELISA avalia a atividade do antígeno ou determina a atividade dos anticorpos, o EC50 obtido não é menor quanto melhor, o sinal entra no período de plataforma falsa.(Atingindo o limite de detecção do instrumento, concentração de ligação enzimática menor)Isso reduz a EC50, resultando em dados de afinidade errados, um erro que pode ocorrer quando o ELISA é usado para determinar a afinidade.
Hoje em dia, muitos fornecedores de proteínas antígenas têm essa falácia na avaliação da atividade dos antígenos.

A afinidade entre antígenos e anticorpos é determinada pela estrutura e interação de ambos.Pode ser 0,1 nM, 1 nM ou 1000 nM. Para avaliar o bem ou o mal do método de afinidade ELISA, é necessário verificar se esse valor EC50 corresponde ao valor da afinidade, que pode ser verificado em vários aspectos, como termodinâmica, dinâmica e fluxometria celular em métodos de concentração de saturação.
Por sua vez, quando um método ELISA não existe, tais como sinais para entrar na plataforma falsa(Atingindo o limite de detecção do instrumento, concentração de ligação enzimática menor)Quando a falácia é esperada, seu valor de EC50 só pode realmente refletir o valor numérico da afinidade.

O uso de ELISA para o desenvolvimento metodológico requer uma aplicação clara, quantificação macromolecular e medição de afinidade.
Para diferentes fins de aplicação, as concentrações relativas de dose de antígenos e anticorpos variarão muito, há curvas de dosagem diferentes,Os leitores podem identificar as diferenças em combinação com o estudo comparativo anterior “ELISA Metodology Development Practice Edition – Quantitative Methodology Development for Biomacromolecular Testing”.

Aqui está o compartilhamento, até a próxima!

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