Chegou outra vez a temporada escolar.Experiência WangVoltamos a mudar tijolos.
Como?ExcelenteMovimento de tijolosaindaNão pedir ajuda.Irmão mestre

Claro que sim.Atenção"Pequena aula"ColunasAh!

Hoje apresentamos o pequeno.
É umCarga seca cheiado
Manual prático de métodos de demonstração de fagos
"Ampliação e quantificação de bactériofagos"

É uma nota rara.
Por favor (coleção)!

Parte 1

Híbridos、Clonagem de células únicaseTecnologia de demonstração de fagosSão três tecnologias principais para a descoberta de anticorpos:Tecnologia de demonstração de fagosComoTecnologia de nível Nobeldesempenham um papel importante no desenvolvimento da medicina biológica,* Acelerar o processo de desenvolvimento de anticorpos.Tecnologia de demonstração de fagosNão só desempenha um papel central na descoberta e otimização de novos anticorpos e péptidos, mas também combina-se com a tecnologia imunológica animal tradicional para se encaixar eficazmente com a plataforma de descoberta de nanoanticorpos e ratos geneticamente modificados humanos inteiros.Pode ser amplamente utilizado em áreas como anticorpos, medicamentos acoplados a anticorpos e CAR-T/TCR-T- É.Este artigo irá explorar os detalhes experimentais de proliferação e amplificação de fagos da tecnologia de demonstração de fagos, compartilhar a experiência do processo experimental específico, com seus princípios como fundamento para orientar o processo experimental, para melhorar o processo experimental, aumentar a taxa de sucesso da tecnologia de demonstração de fagos no processo de descoberta de anticorpos.

Parte 2

- Biblioteca de bactériofagos
Princípios básicos de ampliação e exibição.

O sistema de exposição de fragmentos de anticorpos dos fagos, agora comumente utilizado, é chamadoSistema 3+3(3 é a proteína da casca p3 do fago)；3+3Existem duas fontes que representam a proteína da casca p3:

• Bactériofagos (phagemid)
• O fago auxiliar M13KO7

MicrocópiosA proteína p3 no fagémido, que se fundiu com o gene do fragmento de anticorpo, é a chave para a diversidade da biblioteca;Bactériofagos auxiliaresA proteína p3 no fago auxiliar é a proteína p3 natural dos fagos.
* Os fagos são um veículo plasmídico relativamente pequeno, com maior eficiência de conversão no estado de sensibilidade de E. coli e são capazes de se expandir em E. coli.

O E. coli que contém fagos é infectado por fagos auxiliares (Helper Phage), que usa o sistema enzimático, matérias-primas e energia de E. coli para se amplificar, e, finalmente, o fago que contém fagos é liberado de E. coli, e a proteína da casca p3 do subfago apresenta fragmentos de anticorpos.

Parte 3

Durante o processo de expansão de bactérios
Problemas encontrados e soluções correspondentes.

O processo de repositório de fagos é, na verdade, o processo de transmissão da diversidade genética de fragmentos de anticorpos:
O processo de transferência da diversidade de genes de anticorpos em amostras de sangue para os bactériófagos é o conteúdo construído pela biblioteca de bactériófagos;
A diversidade de fagos é transmitida para a diversidade de E. coli que contém fagos, é o conteúdo de plasmóides de fagos para E. coli;
A transmissão da diversidade de E. coli contendo fagos para a diversidade de fagos é o conteúdo da expansão de fagos e também é uma preocupação experimental neste artigo.

O objetivo final da amplificação dos fagos é transformar uma única cópia do fragmento de anticorpo no fago em 10-100 cópias através do processo de amplificação dos fagos.Essas cópias são capazes de mostrar fragmentos de proteína anticorpal na proteína p3 na superfície do fago.

Para que a diversidade da biblioteca seja mantida e transmitida no processo de expansão de fagos, é necessário determinar o número e o volume de E. coli que contêm fagos durante o processo de expansão de acordo com o tamanho inicial da biblioteca, a quantidade de fagos auxiliares adicionados para a infecção eficaz e a quantidade de fagos que contêm fagos adicionados para seleção após a expansão, etc.O volume de expansão necessário para os repositórios de fagos de diferentes tamanhos de biblioteca é diferente durante o processo de expansão.Um esquema experimental curado provavelmente levará à perda da diversidade da biblioteca.
Para esclarecer essas questões, é necessário primeiro ter um conhecimento prévio dos seguintes pontos básicos:

（ 👇 Destaca tudo o que segue!! ）

1. Leituras de E. coli TG1 em OD600: 1OD representa uma concentração de bactéria de 1e9 / ml.
2. Os fagos/fagos auxiliares têm uma eficiência de infecção relativamente boa quando o TG1 está logarígeno* e o OD600 do TG1 está logarígeno* em 0,4-0,8.
3. A taxa de crescimento de TG1 em logarithm * é de 20 minutos por geração, e é necessário prestar atenção ao crescimento de TG1 para a bacteriologia oportuna para o experimento.4. A proporção de fagos auxiliares e TG1 no MOI de 20: 1 é capaz de garantir que todos os TG1 estão infectados.
5. Os fagos que contêm bactérios são capazes de infectar os E. coli TG1 normais e deixam os fagos no TG1 e aumentam à medida que o TG1 aumenta sem fagos auxiliares.
6.Os bactériófagos contêm * resistência e os bactériófagos auxiliares contêm * resistência.
7. Os fagos que contêm bactériófagos podem ser titrados infectando placas de agar resistentes a TG1 normal, diluído em gradiente.8.Os fagos que contêm bactérios no modo 3 + 3 mostraram uma eficiência relativamente baixa da proteína de fragmento de anticorpo de fusão p3, apenas 5% -10%, no momento da seleção, a título dos fagos adicionados deve ser mais de 100 vezes a diversidade da biblioteca.
Outra questão mais importante é:Os fagos, como um vírus, podem facilmente se espalhar na forma de aerossóis para o ar e poluir o ambiente do laboratório, infectando assim a E. coli com fator F positivo.(Corre o risco de mudar os tijolos!)
emExperimentos relacionados com os fagos mostradosÉ necessário fazer isso em um laboratório relativamente fechado.Para evitar a contaminação com bactérios fagos por E. coli,Especialmente no cultivo de E. coli TG1 normal. Os fagos são geralmente inactivados por meio de exposição ultravioleta por mais de meia hora.
(Bio-Wang qualificado, um assassino de vírus emotivo!)

Parte 4

- Expansão bacterianaAumento e quantificação
Compartilhamento de processos experimentais específicos.

Aqui está um esquema experimental para expandir a biblioteca de fagos com um tamanho de biblioteca de 1E9.
* Se a biblioteca for muito grande ou muito pequena, você pode aumentar o volume proporcionalmente.

Dia 1
(Um dia calvo de tijolos)

1. Tome 1 ml da espécie TG1 contendo bactériófagos (número de bactérias é 1E10) e adicione a um frasco agitador de 250 ml contendo 100 ml de meio de cultura 2xYT-GA,UtilizaçãoCama de agitação de Ahouse37 graus 220rpm agitador para OD600 de cerca de 0,5- É.2. Tomar 20ml de líquido bactérico com OD600 de aproximadamente 0,5 (número de bactérios é 1E10) e adicionar o fago auxiliar M13 K07 com pfu de 2E11 de acordo com o MOI de 20: 1, oscilando 37 graus 220rpm para a infecção por meia hora.3. Leve o líquido pós-infecção para uso em um tubo de centrifugação de 50 mlCentrífuga 5816R3200g Centrífuga por 10 minutosRemover o meio de cultura para remover a inibição da expressão da proteína de fragmento de anticorpo fuso da proteína p3 nos bactériófagos da glicose no meio de cultura.4. Resuspende o grupo com o meio de cultura 2xYT-AK, adicione o meio para 400 ml e agite durante a noite com um frasco de agitação de 1L a 30 graus e 220 rpm.

Dia 2
(No dia seguinte da calvície)

5.Divida 400 ml em garrafas grandes,UtilizaçãoCentrífuga 5816R Centrífuga de 10000 g por 10 minutosRemova e centrifuge 10.000 g novamente durante 10 minutos.Remover os resíduos de bactéria.6. Tome 90 ml de solução de PEG para adicionar 400 ml de supernatante, incubar a 4 ° C por 1 hora e acompanhado de uma suave oscilação, em seguidaUsando funções de controle de temperatura baixaCentrífuga 5816R 4 ℃ 10000g centrífuga 1 hora- É.7. Depois de ir para a limpeza, re-suspender bactérias com 10ml PBS e adicionar 2,5ml de solução de PEG para precipitar novamente.8. Incubar no gelo por 20 minutos e depoisUsando funções de controle de temperatura baixaCentrífuga 5816R4 ℃ 10000g Centrífuga meia hora- É.9. Subir o líquido, usar papel de absorção de água para secar a solução de PEG residual, adicionar 1-2ml de PBS pesada suspensão, para a determinação da titração.

Determinação da titração:
1. Em um laboratório separado, pegar TG1 E. coli normal para adicionar 2xYT ao meio de cultura,UtilizaçãoCama de agitação de AhouseValor de bactéria até OD600 de 0,5Se não for usado oportunamente, pode ser colocado a 4 ° C por 2 horas para reposição.
2.Diluir 1E5-1E7 vezes com PBS na etapa 9.
3. Tome a diluição de bactériofagos 10ul e adicione 490ul OD600 a E. coli TG1 de 0,5,UtilizaçãoCama de agitação de Ahouse 37 ° C 220rpm oscilação meia horarealizar a infecção.
4. Tome 50 ul de líquido infeccioso e aplique uniformemente em uma placa de resina contendo 2xYT-GA e, após secar, coloque-o em uma incubadora de 37 ° C durante a noite. E a placa de agar não infectada com E. coli TG1 foi aplicada como controle negativo.

Dia 3
(Terceiro dia da calvície)

5. Número de clones na placa de aguna de 2xYT-GA, com base no múltiplo de diluição calculado a titração dos fagos amplificados
Título de fago (pfu / ml) = (número de clones * 10 * 50 / 10ul) * múltiplo de diluição
6.Os fagos 1E11-1E12 são usados ​​para seleção.

Fórmula do reagente:
2xYT meio de cultura:Extrato de levedura 10,0 g/L + triptona 16,0 g/L + NaCl 5,0 g/L
2xYT-GA meio de cultura:2xYT + 100 μg / ml * + 1% (W / V) de glicose
2xYT-AK meio de cultura:2xYT + 100 μg / ml * + 50 μg / ml *
PEG溶液：20% (p/v) PEG 6000, NaCl 2,5 M

Parte 5
Instrumentação*:

(Todos os dias de pesquisa civil não está sozinho, porque tem a companhia do pequeno Oe)

Os fagos, como um vírus, podem facilmente se espalhar na forma de aerossóis no ar e contaminar o ambiente do laboratório, exigindo um laboratório fechado onde todos os instrumentos do laboratório devem ser usados ​​separadamente.
OrhausCama de agitação de cultivo de carga leve termostáticaA gama de velocidades de rotação de 100-12 rpm, volume intensivo e poderoso, oferece excelentes efeitos de oscilação para suas amostras:

Além disso, há diferentes volumes, velocidades de rotação diferentes e etapas de centrifugação que requerem condições de 4 ° C durante o processo de demonstração de fagos.commuito
CentrífugasAtender às necessidades experimentaisVai causar o vazio dos ativos do equipamento experimental, causando * desperdício!！！

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