Usos comuns
O fotométrico é uma classe muito importante de instrumentos analíticos, seja na física, química, biologia, medicina, ciência dos materiais, ciência ambiental e outras áreas de pesquisa científica, ou na indústria química, medicina, inspeção ambiental, metalurgia e outros setores modernos de produção e gestão, a espectrofotometria visível ultravioleta tem aplicações amplas e importantes. Espectrofotometro é um instrumento que usa espectrofotomia para análise qualitativa e quantitativa de substâncias, muitas vezes usado para quantificar ácidos nucleicos, quantificação de proteínas e quantificação de concentrações de crescimento bacteriano.
O espectrofotômetro ultra-microscópico tornou-se um instrumento convencional para os modernos laboratórios de biologia molecular. É comumente usado para quantificar ácidos nucleicos, proteínas e concentrações de crescimento de bactérias.
Quantificação do ácido nucleico
A quantificação de ácidos nucleicos é uma função da alta frequência de uso de espectrofotômetros ultra-microscópicos. Podem ser quantificados oligonucleótidos dissolvidos em tampão, DNA de cadeia única, dupla e RNA. Os picos de absorção elevados de ácidos nucleicos têm um comprimento de onda de absorção de 260nm. A composição molecular de cada ácido nucleico é diferente e, portanto, seu coeficiente de conversão é diferente. Quantificar os diferentes tipos de ácidos nucleicos, selecionando antecipadamente o coeficiente correspondente. Por exemplo, o valor de absorção de 1OD é equivalente a 50 μg / ml de dsDNA, 37 μg / ml de ssDNA, 40 μg / ml de RNA e 30 μg / ml de Olig, respectivamente. Os valores de absorção fotográfica após o teste são convertidos pelos coeficientes acima para obter a concentração da amostra correspondente. Antes do teste, selecione o procedimento correto, introduza o volume do líquido original e diluído e, em seguida, teste o líquido vazio e o líquido da amostra. No entanto, a experiência não foi suave. A instabilidade das leituras pode ser um problema com a dor de cabeça do experimentador. Quanto maior a sensibilidade do instrumento, maior o valor de absorção fotográfica exibida.
De fato, o princípio de projeto e o princípio de funcionamento do espectrofotômetro permitem que os valores de absorção de luz variem dentro de uma determinada faixa, ou seja, o instrumento tem uma certa precisão e precisão. Por exemplo, a precisão do espectrofotômetro ultra-microscópico Berch Colibri na Alemanha é ≤1,0% (1A). É normal que os resultados de vários testes flutuam em torno de 1,0% da média. Além disso, também é necessário considerar as propriedades materializantes do próprio ácido nucleico e o valor de pH do tampão de ácido nucleico dissolvido, a concentração de íons, etc.: no teste, a concentração de íons é muito alta e também pode levar à deriva de leituras, por isso, é recomendado usar um tampão com um certo valor de pH e concentração de íons mais baixa, como TE, que pode estabilizar significativamente as leituras. A concentração de diluição da amostra também é um fator que não pode ser negligenciado: devido à inevitável presença de pequenas partículas na amostra, especialmente a amostra de ácido nucleico. A presença dessas pequenas partículas interfere com o efeito do teste. Para reduzir significativamente o impacto das partículas nos resultados do teste, é necessário que o valor de absorção de ácido nucleico seja pelo menos maior que 0,1A e o valor de absorção esteja entre 0,1 e 1,5A. Nesta faixa, a interferência das partículas é relativamente pequena e os resultados são estáveis. Isso significa que a concentração da amostra não pode ser muito baixa ou muito alta (excedendo a faixa de teste do fotômetro). Fatores operacionais, como a mistura para ser suficiente, caso contrário, o valor de absorção é muito baixo, até mesmo um valor negativo; A mistura não pode ter bolhas, o líquido vazio não tem suspensão, caso contrário, as leituras flutuam fortemente; O líquido vazio e a amostra devem ser testados usando o mesmo copo de comparação de cor, caso contrário, a diferença de concentração é muito grande; Coerente seleção de coeficientes de conversão e unidades de concentração da amostra; Não é possível usar copos de cor desgastados pela janela; O volume da amostra deve atingir várias questões operacionais, tais como o volume menor do que o requisito do copo de cor.
Além da concentração de ácidos nucleicos, o espectrofotômetro mostra simultaneamente vários ratios muito importantes para representar a pureza da amostra, como a relação A260/A280, usada para avaliar a pureza da amostra, uma vez que o pico de absorção da proteína é de 280nm. Amostras puras têm ratios maiores que 1,8 (DNA) ou 2,0 (RNA). Se o valor for inferior a 1,8 ou 2,0, indica a presença de proteínas ou fenóides. A230 indica a presença de alguns poluentes na amostra, como carboidratos, polipéptidos, etc., com a relação de ácido nucleico A260/A230 mais puro maior que 2,0. O A320 detecta a turbididade da solução e outros fatores de interferência. Na amostra pura, o A320 é geralmente 0.
Quantificação direta de proteínas
Este método testa a proteína diretamente no comprimento de onda de 280nm. Selecionando a fórmula de Warburg, o fotométrico mostra diretamente a concentração da amostra ou, selecionando o método de conversão correspondente, converte o valor de absorção para a concentração da amostra. O processo de determinação de proteínas é muito simples, testando primeiro o líquido vazio e, em seguida, testando a proteína diretamente. Devido à presença de algumas impurezas no tampão, a informação de "fundo" de 320nm é geralmente eliminada e esta função é definida como "ativada". Semelhante ao ácido nucleico de teste, o valor de absorção do A280 é exigido pelo menos maior que 0,1A e varia linearmente entre 1,0 e 1,5. Quando a fórmula de Warburg foi selecionada no experimento para mostrar a concentração da amostra, as leituras foram encontradas "drifting". É um fenômeno normal. De fato, desde que a variação observada no valor de absorção da A280 não exceda 1%, o resultado é muito estável. A razão para a deriva é porque a fórmula de Warburg converte o valor de absorção em concentração, multiplicado por um determinado coeficiente, desde que o valor de absorção mude ligeiramente, a concentração será amplificada, o que resulta instável. O método de quantificação direta de proteínas é adequado para testar proteínas mais puras e com um componente relativamente único. Quantificação direta ultravioleta em relação à comparação de cores, rápida e fácil de operar; Mas é vulnerável a interferências de substâncias paralelas, como interferências de DNA; Além disso, a sensibilidade é baixa, exigindo altas concentrações de proteínas.
Quantificação de proteínas cromáticas
As proteínas são geralmente compostos de várias proteínas, e a coloração é baseada na composição da proteína: aminoácidos (como *, *) reagem com grupos coloridos ou corantes adicionais para produzir substâncias coloridas. A concentração de substâncias coloridas está diretamente relacionada com o número de aminoácidos em reação à proteína e, portanto, a concentração da proteína em reação.
Os métodos de comparação de cores geralmente têm vários métodos como BCA, Bradford, Lowry e outros.
Método de Lowry: Baseado em reações iniciais de Biuret e melhorado. A proteína reage com Cu2 para produzir um reagente azul. No entanto, o método Lowry é mais sensível do que o Biuret. A desvantagem é a necessidade de adicionar vários reagentes de reação diferentes em sequência; Tempo de resposta mais longo; Sensibilidade a substâncias não proteicas; As proteínas que contêm substâncias como EDTA, Tritonx-100, sulfato de amoníaco não são adequadas para esse método.
BCA (Bicinchoninineacidassay): É um teste de proteína mais novo e sensível. A proteína a ser analisada reage com Cu2 em solução alcalina para produzir Cu, que forma um quelato com BCA, formando um composto roxo que absorve picos em comprimentos de onda de 562nm. A relação linear deste composto com a concentração de proteína*, o composto formado após a reação é muito estável. Em comparação com o método Lowry, a operação é simples e altamente sensível. Mas, semelhante ao método de Lowry, é vulnerável à interferência entre proteínas e descontaminantes.
Método de Bradford: o princípio deste método é que a proteína reage com a ligação de Cobalt, produzindo um pico de absorção de compostos coloridos de 595nm. Caracterizada por uma boa sensibilidade, 2 vezes superior aos métodos de teste Lowry e BCA; Operação mais simples e mais rápida; Só é necessário um reagente de reação; O composto pode ser estável por 1 hora, facilitando os resultados; Além disso, é compatível com uma série de agentes redutores que interferem com a reação de Lowry, BCA (como DTT, mercetal etanol). No entanto, ainda é sensível aos contaminantes. A principal desvantagem é que diferentes padrões podem resultar em resultados muito diferentes e incomparáveis para a mesma amostra.
Alguns pesquisadores que entraram em contato inicial com comparações cromáticas podem estar confusos sobre qual método confiar? Como os grupos de reação e os grupos de coloração são diferentes em vários métodos, a utilização simultânea de vários métodos é incomparável para as concentrações de amostra obtidas na mesma amostra. Por exemplo, Keller e outros testaram proteínas no leite humano, e os resultados de Lowry mostraram concentrações significativamente mais altas do que Bradford. Mesmo quando a mesma amostra é medida, a amostra padrão escolhida pela mesma cromatografia não é consistente e a concentração após o teste não é consistente. Por exemplo, usando Lowry teste de proteína na homologação celular, com BSA como padrão, concentração de 1,34 mg / ml, globulina a como padrão, concentração de 2,64 mg / ml. Portanto, antes de escolher a cromatologia, procure proteínas padrão com composição química semelhante como padrão, com referência à composição química da amostra a ser testada. Além disso, o problema frequente com a quantificação de proteínas por cromatografia é que a absorção da amostra é muito baixa, o que leva à maior diferença entre a concentração da amostra medida e a concentração real. O problema chave é que a cor do copo de comparação de cores é um acessório importante do espectrofotômetro 1011 após a reação tem uma determinada meia-vida, por isso cada comparação de cores lista o tempo de teste de reação e todas as amostras (incluindo amostras padrão) devem ser testadas durante esse tempo. O tempo é longo demais, o valor de absorção de luz é menor e o valor de concentração convertido é menor. Além disso, a temperatura de reação, o valor de pH da solução, etc., são razões importantes para afetar o experimento. Além disso, é muito importante usar a coloração do plástico. Evite usar copos de quartzo ou vidro, porque a cor após a reação pode deixar o quartzo ou o vidro colorido, resultando em valores de absorção de luz imprecisos da amostra.
O OD600
O laboratório determina a densidade de crescimento e a proliferação das bactérias*, principalmente para inferir a densidade de crescimento das bactérias com base em experiências e observações. Em experimentos mais exigentes, é necessário usar um espectrofotômetro para medir com precisão a densidade das células bacterianas. O OD600 é o método padrão para rastrear o crescimento de micróbios em culturas líquidas. Tomar a cultura de líquido não adicionado como líquido em branco, depois de uma cultura quantitativa de líquido contendo bactérios. Para garantir o funcionamento correto, é necessário fazer uma contagem celular com microscópio para cada microorganismo e cada instrumento, fazendo curvas de correção. Ocasionalmente, o valor de OD da bactéria aparece negativo no experimento, devido à utilização de um meio de cultura de coloração, ou seja, a cultura bacteriana após um período de tempo, reage com o meio de cultura e ocorre uma reação de decoloração. Além disso, é importante notar que as amostras testadas não podem ser centrifugadas para manter as bactérias em suspensão.